Anatomia Patologica e Citogenetica

Il Servizio di Patologia clinica e Citogenetica si propone di identificare le esigenze di Ricerca e Diagnostica per analisi della più vasta gamma di alterazioni tessutali nell’uomo e in modelli murini, allo scopo di stabilire una relazione casuale tra le alterazioni tessutali e le modificazioni genetiche o alterazioni cromosomiche indotte in patologie oncologiche o di predizione.

Il Servizio provvede al trattamento e alla processazione dei preparati istologici ottenuti a partire da campioni bioptici, consentendo la valutazione e la caratterizzazione fenotipica delle patologie umane più comuni e di modelli murini di tali patologie, quale necessario complemento agli studi di genomica funzionale.

Il Servizio inoltre offre per Diagnostica prestazioni inserite nel prontuario Nazionale Sanitario per l’identificazione di alterazioni cromosomiche in campioni tumorali solidi (FISH), di natura ematologica (cariotipo e FISH) e per analisi del sistema immunitario infiltrato nei tumori solidi.

Le attività del Servizio di Patologia clinica e Citogenetica in Oncologia ed Ematologia per ricercatori CEINGE e per Ricercatori o Enti Esterni (tramite opportune singole richieste o eventuali convenzioni) comprendono:

1) La collaborazione in termine di attività di Servizio con i Responsabili delle Linee di ricerca allo scopo di ottimizzare il protocollo metodologico nell’utilizzo delle diverse tecniche del laboratorio

2) Il contributo delle tecniche morfologiche allo sviluppo dei progetti di genomica funzionale

3) Lo svolgimento sia delle attività di routine istologica che delle colorazioni dedicate

4) La collaborazione scientifica con i Responsabili delle Linee di ricerca tramite la diagnostica tessutale, l’interpretazione dei risultati e la validazione dei modelli animali

5) Servizi di diagnostica citogenetica oncologica e oncoematologica

Servizi per Ricerca

• Processazione e inclusione in paraffina (standard)

Le biopsie pervenute vengono posizionate in biocassette che vengono poi  poste nel processatore automatico VTP 300 di Bio-Optica dove i campioni vengono  disidratati per permettere alla paraffina di penetrare nel tessuto e renderlo così idoneo al taglio.

• Processazione e inclusione in paraffina (decalcificazione)

I campioni ossei prima di essere processati devono essere decalcificati. Nella nostra facility questo processo viene fatto utilizzando EDTA pH8. Esso è un agente chelante che non danneggia i tessuti che possono così, essere sottoposti a metodiche istochimiche.

• Inclusione in O.C.T.

Il campione viene disidratato in una soluzione di saccarosio al 30% in PBS. A disidratazione avvenuta (il campione precipita sul fondo) esso viene posto in una soluzione costituita al 50% di saccarosio/PBS al 30% e di O.C.T. ON a 4° C. Il pezzo è quindi pronto per una rapida inclusione in mold contenente O.C.T. L’operazione viene eseguita su ghiaccio secco. L’incluso viene conservato in congelatore a -80° C.

• Taglio

Il taglio dei blocchi inclusi in O.C.T. o in paraffina è effettuato grazie alla stazione di taglio che comprende sia criostato che microtomo automatico rotativo. Le sezioni sono raccolte o su semplici vetrini molati o su vetrini polarizzati a seconda delle procedure a cui devono essere sottoposti i campioni.

• Colorazioni istochimiche

La colorazione di routine dei vetrini con Ematossilina ed Eosina e le altre colorazioni istomorfologiche ed istochimiche speciali utili per la visualizzazione di strutture tessutali, microorganismi e granuli, vengono eseguite con il coloratore automatico Leica ST 5020 (*) Per la colorazione Ematossilina/ Eosina viene utilizzato il Kit Infinity (Leica). Il montaggio dei vetrini è affidato al sistema automatico Leica CV 5030.

(*) Per altre colorazioni intendiamo Reazione di PAS (Collageno e Fibrina); Luxol fast blue (mielinizzaione-demielinizzazione); Alazarin red (misurazione della osteogenesi, ioni Ca⁺⁺); Oil red (contenuti di Lipidi); Cresyl Violet (nissl- stain-neuroni); Peris (depositi di ferro tissutale).

• Colorazioni immunoistochimiche

Questa tecnica utilizza un anticorpo (sonda) per rilevare la presenza e la localizzazione di uno specifico antigene (bersaglio). La rilevazione del bersaglio può essere effettuata usando anticorpi secondari coniugati con l’enzima perossidasi, in questo caso si usa come substrato dell’enzima la DAB. La reazione, visibile in campo chiaro, sviluppa una colorazione “brown”. Qualora l’anticorpo secondario è coniugato con fluorocromi, il vetrino dopo la controcolorazione dei nuclei con il DAPI , viene montato e analizzato al microscopio a fluorescenza.

• LCM - Micro dissezione laser

Il laboratorio dispone del Sistema Leica LMD 6500 per la microdissezione laser in grado di lavorare anche in condizioni di fluorescenza ed anche con colture cellulari. Le sezioni vengono posizionate su vetrini  costituiti da una particolare membrana che viene tagliata dal laser insieme all’area d’interesse  precedentemente individuata. La raccolta del campione avviene per gravità senza apporto di nessuna  forza esterna. Ciò previene ogni contaminazione poiché il campione microdissezionato cade direttamente nel mezzo di raccolta.

• Telepatologia – Acquisizione di vetrini in campo chiaro e con fluorescenza-

Il laboratorio mediante lo scanner Leica SCN 400F è in grado di acquisire immagini digitali di un numero elevato di vetrini  e di  acquisirne dati ad alta definizione in campo chiaro e in fluorescenza. Lo strumento è corredato di un software che ne permette anche un’accurata analisi. Le immagini vengono archiviate in una istoteca virtuale il cui accesso, mediante account opportuno, è permesso anche da accesso remoto. Ciò risulta utile sia in ricerca che in diagnostica poiché, grazie al suo collegamento in rete, permette la visione e quindi lo studio dell’immagine in contemporanea con più esperti  consentendo così confronti senza spostamenti (Digital Pathology). La facility si propone anche, come un vero e proprio servizio di archiviazione di casi con il vantaggio che la qualità delle immagini non decade nel tempo come accade invece nelle istoteche “fisiche”.

• Diagnostica Sperimentale

Ai servizi e alle prestazioni sopraelencati destinati in prevalenza alla ricerca scientifica di base, la Facility è in grado di svolgere attività di ricerca scientifica in campo biomedico e di promuovere il trasferimento dei risultati alla pratica clinica ed in particolare alla diagnostica clinica. La piattaforma si propone di far fronte a richieste assolutamente innovative che provengono dal comparto biomedico. E proprio seguendo questo obiettivo che la Facility ha allestito per la diagnosi dei tumori solidi, sia di età adulta che pediatrica, da una parte un laboratorio che ricerchi i marcatori molecolari “classici” della patologia e dall’altra un laboratorio di “diagnostica sperimentale” per il censimento mediante IHC, delle cellule immunologiche del microambiente tumorale ovvero l’dentificazione di biomarcatori predisponenti alla terapia stessa. L’identificazione del giusto paziente e della giusta terapia, infatti, è essenziale nello sviluppo di percorsi immunologici personalizzati. Tutto ciò è reso possibile grazie alla presenza di strumenti di ottima tecnologia che garantiscono un’alta standardizzazione delle metodiche come il coloratore automatizzato IHC/ISH Bond III di Leica.

            La nostra Facility è in grado di identificare i seguenti antigeni:

• Marcatori tumorali “classici”: PD1, PDL1, TP53, BRAF V600E

• Marcatori del microambiente tumorale: CD4, CD8, CD25, Fox-P3, PD1, CTLA4, PDL1, CD68, CD163, CD49, Gr1, CD11b, Arginase, CD11c.

Servizi per Diagnostica

Il Laboratorio di diagnostica offre le prestazioni di seguito elencate, incluse nel Sistema Nazionale Sanitario, relativamente a patologie oncologiche e oncoematologiche per tutto il territorio Nazionale, sia per Enti pubblici che per enti Privati.

Citogenetica convenzionale oncoematologica

Prestazioni erogate

• (91.31.3) Cariotipo da metafasi spontanee di midollo osseo

• (91.34.5) Coltura di linfociti periferici con PHA o altri mitogeni

• (91.31.2) Cariotipo da metafasi linfocitarie

• (91.33.5) Coltura di cellule di altri tessuti

• (91.32.1) Colorazione aggiuntiva in bande: Bandeggio C

• (91.32.2) Colorazione aggiuntiva in bande: Bandeggio G

• (91.32.3) Colorazione aggiuntiva in bande: Bandeggio G ad alta risoluzione

• (91.32.4) Colorazione aggiuntiva in bande: Bandeggio NOR

Le indagini di citogenetica convenzionale consistono nella ricostruzione del cariotipo e consentono l’individuazione di anomalie cromosomiche sia di tipo numerico (trisomie, monosomie) sia di tipo strutturale (traslocazioni, delezioni, inversioni).

Nell’ambito delle patologie oncoematologiche, la ricerca di alterazioni cromosomiche, su campioni di sangue midollare o periferico, assume un ruolo fondamentale nel confermare un sospetto diagnostico e rappresenta un importante strumento per la stadiazione prognostica e, spesso, per le scelte terapeutiche. Le anomalie riscontrate al cariotipo possono inoltre essere utilizzate come marcatori per il monitoraggio della terapia.

Citogenetica molecolare oncologica e oncoematologia: fluorescent in situ hybridization (fish)

Prestazioni erogate:

• (91.37.2) Ibridazione in situ (FISH) su metafasi, nuclei interfasici, tessuti mediante sequenze genomiche in YAC

• (91.37.3) Ibridazione in situ (FISH) su metafasi, nuclei interfasici, tessuti mediante sonde molecolari a singola copia in cosmide

• (91.37.4) Ibridazione in situ (FISH) su metafasi, nuclei interfasici, tessuti mediante sonde molecolari alfoidi ed altre sequenze ripetute

La Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) consiste nello studio di specifiche regioni cromosomiche attraverso l’utilizzo di sonde molecolari marcate con fluorocromi. Esse, attraverso la complementarietà delle basi, si legano ad una regione cromosomica di interesse, permettendo di localizzarla e identificare una sua alterazione nella posizione (traslocazione e inversione), una sua assenza (delezione, monosomia), o una sua aggiunta (duplicazione, amplificazione).

Essa è applicata, in metafase e/o in interfase, ad un’ampia varietà di campioni biologici, sulla base di specifici sospetti diagnostici o per una migliore definizione di anomalie riscontrate al cariotipo.

Si utilizzano:

• Sonde locus specifiche, che, ibridando a specifici loci cromosomici, consentono di individuare piccoli riarrangiamenti strutturali quali delezioni, duplicazioni, traslocazioni e/o inversioni.

• Sonde centromeriche, che consentono di identificare anomalie cromosomiche numeriche.

  • Sonde telomeriche, che si legano alle regioni sub-telomeriche presenti nelle regioni terminali dei cromosomi.

  • Sonde painting, che ibridano all’intero cromosoma e rappresentano un importante strumento per l’identificazione di anomalie cromosomiche strutturali.

In particolare essa è applicata:

• In oncologia: come supporto diagnostico all’indagine morfologica classica e a significato prognostico e predittivo.

• In oncoematologia:

  • Durante la terapia, allo scopo di monitorarne l’andamento.

  • Alla diagnosi, allo scopo di chiarire anomalie riscontrate tramite tecniche di citogenetica convenzionale o in caso di fallimento delle stesse.

Tutta l’attività è svolta attraverso utilizzo di biomarcatori comuni e sonde cromosomiche come da lista disponibile su richiesta alla nostra amministrazione CEINGE.

L’ottenimento del dato e la sua refertazione sono effettuati grazie a personale qualificato con esperienze diagnostiche nel campo della Genetica Umana e con focus nel campo della definizione delle alterazioni cromosomiche e definizione del cariotipo umano.

La tipologia di test, le metodologie impiegate e i processi analitici sono costantemente aggiornati e in linea con gli standard qualitativi del disciplinare della Società Italiana di Genetica Umana (SIGU).

In particolare, il Laboratorio si attiene alle:

1) Linee guida per la diagnosi citogenetica 2013 a cura del gruppo di lavoro in Citogenetica SIGU (Società Italiana di Genetica Umana).

2) Linee guida E.C.A:

• Guidelines and Quality Assurance for Acquired Cytogenetics (European Cytogeneticists Association – ECA, Newsletter 31 gennaio 2013)

• FISH on histological sections of solid tumors: European Cytogeneticists Association E.C.A. recommendations (European Cytogeneticists Association – ECA, Newsletter 29 Gennaio 2012)

3) American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) standards and guidelines for clinical genetics laboratories 2018 Edition

4) European recommendations and quality assurance for cytogenomic analysis of haematological neoplasms- K. A. Rack, E. van den Berg, C. Haferlach, H. B. Beverloo, D. Costa, B. Espinet, N. Foot, S. Jeffries, K. Martin, S. O’Connor, J. Schoumans, P. Talley, N. Telford, S. Stioui, Z. Zemanova, R. J. Hastings. Leukemia, 29/01/2019 -https://doi.org/10.1038/s41375-019-0378-z