Proteomica

Servizi di Spettrometria di massa

Peso Molecolare accurato di Peptidi e Proteine

Determinazione del peso molecolare accurato di peptidi e proteine mediante analisi con tecniche di spettrometria di massa ESI-MS o MALDI-MS. Ove necessario si provvede anche alla      desalificazione del campione mediante HPLC.

Peptide mapping, modifiche post-traduzionali e varianti

Completa caratterizzazione di proteine native e ricombinanti, analisi di proteine varianti e di mutanti, identificazione di modifiche post-traduzionali, epigenetiche, maturazione proteolitica e assegnazione dei ponti S-S, ecc. Pre-trattamento dei campioni sia in soluzione che in gel, idrolisi enzimatica, mass mapping

Analisi LC-MS di proteine

Separazione di proteine mediante HPLC e determinazione diretta del loro peso molecolare accurato mediante spettrometria di massa ESI-MS.

Sequenza di Peptidi mediante Spettrometria di Massa Tandem

Separazione di peptidi mediante HPLC o analisi diretta di campioni purificati e determinazione della sequenza mediante esperimenti di spettrometria di massa tandem.

Analisi di Glicoproteine

Completa caratterizzazione delle catene oligosaccaridiche in glicoproteine. Digestione della proteina, “stripping” enzimatico delle glicoforme, profilo MALDI-MS delle glicoforme ed identificazione dei siti di N-glicosilazione.

Analisi di oligonucleotidi, oligosaccaridi, piccole molecole in generale

Analisi di massa MALDI-MS o ESI-MS di oligonucleotidi sintetici o di oligosaccaridi di estrazione e/o sintesi per la determinazione accurata del peso molecolare

Servizi di Proteomica

Separazione di campioni proteici mediante SDS-PAGE

Frazionamento di campioni proteici mediante SDS-PAGE finalizzata alla successiva identificazione delle bande proteiche.

Identificazione di proteine mediante LC-MS/MS

Identificazione di proteine purificate, in soluzione o frazionate mediante metodologie elettroforetiche mono o bidimensionali. Escissione delle bande proteiche, digestione in situ, analisi LC-MS/MS della miscela di peptidi, ricerca in banche dati.

Esperimenti di proteomica differenziale (tipologia “untargeted label free”) associata ad analisi LC-MS/MS per identificazione e quantificazione relativa delle proteine (inclusa analisi statistica)

Identificazione e quantificazione di proteine differenzialmente espresse in linee cellulari o tessuti mediante metodologie di spettrometria di massa tandem secondo l'approccio label free. L'intero contenuto di proteine viene estratto da campioni, digerito con tripsina su fase solida, e sottoposto ad analisi LC-MS/MS utilizzando spettrometri di massa ad alta risoluzione (con analizzatori tipo Orbitrap o Q-ToF). I raw file ottenuti dall’analisi LC-MS/MS sono analizzati con il software MaxQuant per l’identificazione e quantificazione delle proteine. Il “protein groups” ottenuto è sottoposto ad analisi statistica per la determinazione delle proteine significativamente sovra- o sotto-espresse, in accordo con i Fold Changes misurati.

Analisi “targeted” per quantificazione relativa e/o assoluta di proteine mediante MRM

L’estratto proteico viene trattato su opportune cartucce, procedendo con riduzione dei ponti disolfurici, alchilazione dei residui di cisteina, idrolisi con tripsina e sottoposto ad analisi per quantificazione di proteine mediante MRM (Multiple Reaction Monitoring). Per ogni proteina da analizzare verranno selezionati almeno due peptidi proteotipici (ovvero specifici) mediante l’utilizzo del software Skyline che fornisce un elenco dei migliori peptidi candidati come standard per questo tipo di analisi, le migliori transizioni virtuali (ione molecolare-ione frammento) e l’energia di collisione per generare la massima resa di frammentazione. L’analisi MRM sarà condotta monitorando le transizioni specifiche dello ione molecolare e dei singoli frammenti per ogni peptide selezionato, utilizzando un sistema ifenato costituito dal nanoHPLC accoppiati a spettrometri di massa a triplo quadrupolo. La quantificazione delle proteine potrà essere di tipo relativo o anche determinata in maniera assoluta. In quest’ultimo caso verrà ottenuta mediante interpolazione con le rette di calibrazione costruite a partire da peptidi sintetici identici a quelli individuati dall’analisi Skyline per il monitoraggio della proteina. I peptidi selezionati potranno essere acquistati anche in forma marcata (con C13 o N15) ed impiegati come standard interno per procedure di normalizzazione.

Servizi di Interattomica

Analisi di interazioni tra biomolecole o biomolecole e ligandi generici attraverso Surface Plasmon Resonance

Attraverso l’immobilizzazione della biomolecola di interesse su chip opportunamente derivatizzati, ed incubazione con il/i potenziali ligandi, si andrà a misurare la variazione dell’indice di rifrazione superficiale; questi cambiamenti sono direttamente proporzionali alla massa legata al biosensore che ovviamente varia in presenza di una interazione. Dalle misure diffrattometriche è possibile estrapolare, in opportune condizioni sperimentali, costanti termodinamiche e cinetiche che caratterizzano l’interazione. Le biomolecole e i ligandi da testare devono essere forniti dal committente.

Purificazione delle proteine mediante esperimenti di cromatografia di affinità e/o immunoprecipitazione (Interattomica)

Esperimenti in batch finalizzati alla purificazione di specifiche proteine e/o di complessi proteici utilizzando procedure di affinità (es: his-tag based, o affinità per specifici ligandi) oppure strategie di immunoprecipitazione. Il setting sperimentale e i materiali specifici per la proteina da purificare verranno forniti dal cliente. La procedura prevede lisi cellulare, pre-cleaning in assenza di anticorpo, immunoprecipitazione e verifica western blot della presenza della proteina esca