Claudia De Lorenzo

L’immunoterapia, basata sull’impiego di nuovi anticorpi umani dotati di attività antitumorale o immunomodulatoria, rappresenta un’importante strategia per la terapia del cancro. Gli anticorpi monoclonali possono essere diretti contro Antigeni Associati a Tumore (TAA), allo scopo di inibire la loro funzione oncogenica, oppure contro proteine di superficie di cellule del sistema immunitario (Immunecheckpoints, IC), per modulare specifiche risposte dei linfociti T contro il cancro. Nel nostro laboratorio sono stati prodotti con successo nuovi immunoagenti umani con attività antitumorale diretti contro il Recettore Tirosina-Chinasico ErbB2, un noto Antigene Associato a Tumore, iper-espresso nel carcinoma mammario ed in diversi altri tipi di tumore. In particolare, è stato isolato, mediante la tecnologia “phage display” applicata su cellule tumorali vive, un frammento anticorpale interamente umano, chiamato Erbicin, capace di legare un epitopo del recettore ErbB2 diverso rispetto a quello riconosciuto dagli anticorpi Trastuzumab e Pertuzumab, attualmente in uso clinico. Mediante la fusione di Erbicin con il dominio Fc di un anticorpo umano con isotipo IgG1 è stato anche generato un “anticorpo compatto” umano (ErB-hcAb, 100 kDa) contro il recettore ErbB2, che si è mostrato capace di inibire efficientemente, sia in vitro che in vivo, la crescita di tumori ErbB2-positivi senza mostrare gli effetti cardiotossici di Trastuzumab. Come ulteriore progresso, la fusione dei 3 domini di legame derivati da Erb-hcAb, Trastuzumab e Pertuzumab, ha consentito di ottenere un derivato trispecifico, chiamato Tribody, che riconosce 3 epitopi non competitivi sul dominio extracellulare del recettore ErbB2 inducendone efficiente degradazione. Un altro tribody bi-specifico (ErbB2 X CD3), contenente sia il sito di legame di Erbicin per l’antigene ErbB2 sia quello per il recettore CD3 dei linfociti T, è stato ottenuto con successo per reclutare e attivare i linfociti T ed indurne la risposta contro le cellule tumorali ErbB2-positive (vedi Fig. 1). Tali Tribodies hanno mostrato i seguenti vantaggi:

₋ sono capaci di legare e di inibire la crescita di un maggior numero di linee cellulari tumorali riconoscendo epitopi presenti anche in tumori Trastuzumab-resistenti quali quelli che esprimono la variante oncogenica di ErbB2 Delta 16, o quelli in cui l’epitopo di Trastuzumab è mascherato dall’interazione con MUC4, CD44 o altri recettori di superficie;

₋ combinano e potenziano gli effetti terapeutici dei tre differenti anticorpi (Trastuzumab, Pertuzumab and Erb-hcAb) in un solo costrutto, avendo pertanto il vantaggio di consentire la riduzione dei costi di produzione rispetto a quelli di 3 diversi anticorpi.

₋ Consentono di indurre un efficiente risposta mediata dai linfociti T grazie al reclutamento indipendente da MHC (Fig.1).

Tuttavia, un’elevata percentuale di carcinomi mammari aggressivi risulta caratterizzata dall’assenza di ErbB2, come quelli tripli negativi (TNBC). Pertanto, come nuovo bersaglio abbiamo considerato la Nucleolina (NCL), una proteina multifunzionale selettivamente espressa sulla superficie delle cellule tumorali TNBC che regola la biogenesi di alcuni microRNA coinvolti nella tumorigenesi e nella chemioresistenza. Abbiamo quindi isolato, mediante tecnologia del phage display, un scFv umano diretto contro la Nucleolina (NCL), dotato di effetti anti-tumorali selettivi. Stiamo inoltre programmando l’isolamento di scFvs anche contro altri antigeni associati a TNBC o espressi su cancer stem cells.

Parallelamente, abbiamo effettuato uno screening massivo di un repertorio di fagi esprimenti frammenti anticorpali umani allo scopo di ottenere una collezione di anticorpi interamente umani con attività immunomodulatoria diretti contro una vasta gamma di molecole chiave regolatrici del sistema immunitario, utili per la terapia del cancro in monoterapia o in trattamenti combinatoriali. A tale scopo, abbiamo usato per la prima volta una strategia di selezione su linfociti umani attivati allo scopo di generare un’ampia collezione di frammenti anticorpali a singola catena (scFvs) diretti contro 10 differenti IC, chiamata “Immunoma”, dalla quale attraverso cicli successivi di selezione su proteine ricombinanti purificate fosse possibile ottenere scFvs capaci di riconoscere specificamente ciascun recettore. Tecniche di sequenziamento di ultima generazione e analisi di bioinformatica ci hanno consentito di identificare le sequenze degli scFvs più arricchite per ciascuna selezione. Sono stati generati anticorpi umani a partire da tre di queste collezioni (i.e. PD-1, PD-L1 e LAG-3), che sono stati analizzati per la loro capacità di legame ed attività biologica. In particolare, essi sono risultati capaci di riconoscere specificamente i propri bersagli e legarli con alta affinità, di attivare efficientemente la proliferazione dei linfociti T, di indurre la secrezione delle citochine ed inibire la crescita tumorale in vivo. E’ interessante notare che i nuovi anticorpi isolati hanno un’affinità di legame ed un’attività biologica paragonabile o anche migliore di Nivolumab, l’anticorpo in uso clinico specifico per PD-1. Ci proponiamo di caratterizzare anche gli anticorpi specifici per gli altri IC per verificare la loro efficacia in monoterapia ed in trattamenti combinatoriali.

Infine, allo scopo di esplorare la possibilità di potenziare gli effetti antitumorali degli anticorpi diretti contro TAA e di quelli con attività di modulazione del sistema immunitario, stiamo valutando gli effetti di alcuni trattamenti combinatoriali sia per la loro attivita’ antitumorale che per la loro eventuale cardiotossicità mediante saggi su cardiomiociti umani in vitro e su modelli murini in vivo. Le migliori combinazioni di anticorpi sia per efficacia che per ridotta tossicità aspecifica saranno scelte per la costruzione di nuovi costrutti bi- o tri-specifici, come quelli descritti sopra, che avranno il vantaggio di legare simultaneamente più bersagli aumentando la loro specificità di azione, di ridurre i costi di produzione e di attivare il sistema immunitario contro le cellule tumorali presentando proprietà farmacocinetiche ottimali.